SDS-PAGE原理(下)-.ppt

电泳槽SDS-PAGE蛋白电泳上样缓冲液增加样品密度以确保蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。

上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。

指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。考马斯亮蓝〔CoomassieBrilliantBlue〕

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律〔Beer’slaw〕。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光汲取由465nm变成595nm，通过测定595nm处光汲取的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，浮现最大光汲取，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光汲取值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，准确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有堆叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。考马斯亮蓝G-250〔CoomassiebrilliantblueG-250〕

测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光汲取在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光汲取。其光汲取值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。Triton-100

Triton-100洗涤剂透压的裂解去垢剂〔〕通过形成微团能溶解细胞膜的疏水结构。是温柔的，非离子的去垢剂，不会使得蛋白质变性〔相比较接下来马上要
用到的SDS来说〕。