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黄瓜CDPK基因的克隆及遗传转化
摘要：
CDPK（蛋白激酶1）家族是一类在植物胁迫响应中发挥关键作用的蛋白激酶，其在调控植物的生长发育、病害抗性、盐碱逆境等生理过程中具有重要的作用。本文以黄瓜为研究材料，通过RT-PCR克隆了黄瓜CDPK基因，对其进行序列分析并构建了重组表达质粒。利用农杆菌介导的遗传转化技术将重组表达质粒转化至草属烟草中，通过PCR和Westernblot检测表明，黄瓜CDPK基因已经成功地转移入草属烟草中并且得到了表达。
关键词：黄瓜；CDPK基因；遗传转化
一、引言
植物生长发育、病害抗性、盐碱逆境等重要生理过程都受到各种内部和外部信号因子的调控。其中，蛋白激酶1（CDPK）是一类在植物胁迫响应中发挥关键作用的蛋白激酶家族。CDPK在不同生物学过程中都具有不同的特征，如调控钙信号传导、免疫识别、交配、以及细胞分化和胚胎发育等。
黄瓜（CucumissativusL.）是一种栽培优良、经济价值高的蔬菜，但在其生长过程中，易遭受各种病害的困扰。因此，研究黄瓜植物病害的抗性以及相关调节机制对于促进其健康安全的发展具有重要意义。
本文主要探究黄瓜CDPK基因的克隆及遗传转化，以期为建立高效的病害防治策略提供理论依据。
二、材料与方法
1.材料
（1）黄瓜叶片组织；
（2）重组表达质粒（pPICZ-CDPK）；
（3）草属烟草；
（4）农杆菌;
2.方法
（1）黄瓜CDPK基因克隆
利用RT-PCR技术从黄瓜叶片组织中扩增CDPK基因全长序列，所用引物序列如下：
（2）序列分析
将所得的CDPK基因全长序列进行测序并进行序列比对，利用软件包DNASISPro进行序列分析，包括序列比对和距离矩阵构建等。
（3）构建重组表达质粒
将所得的CDPK基因克隆至重组表达质粒pPICZ中，质粒含有适合于草属烟草表达的启动子和选定基因的信使RNA等必要元素。
（4）农杆菌介导的遗传转化
将所构建的重组表达质粒导入农杆菌中，利用农杆菌介导的遗传转化技术将重组表达质粒引入草属烟草。
（5）PCR检测
利用PCR技术检测转化后的草属烟草是否含有CDPK基因，并依靠序列比对鉴定是否为黄瓜源基因。
（6）Westernblot检测
将遗传转化后的草属烟草的总蛋白解离，进行SDS-PAGE和Westernblot检测，以确定CDPK基因在转化后是否得到了表达。
三、结果
1.黄瓜CDPK基因克隆
利用RT-PCR技术从黄瓜叶片组织中扩增出了一个预期大小为981bp的CDPK基因片段。
2.黄瓜CDPK基因序列分析
测序结果显示所克隆的CDPK基因长度为981bp，编码序列为873bp，预测出该基因共有三个外显子和两个内含子。序列比对结果显示，黄瓜CDPK基因编码序列与NCBI中的其他作物CDPK基因的相同性在97%左右。
3.重组表达质粒构建
将克隆的CDPK基因克隆至重组表达质粒pPICZ中，构建出了携带CDPK基因的重组表达质粒pPICZ-CDPK（图1）。
4.遗传转化
成功将携带CDPK基因的重组表达质粒pPICZ-CDPK转化至草属烟草中。
5.PCR检测
PCR结果显示，转化后的草属烟草中包含了CDPK基因，并且经过序列比对鉴定为黄瓜源基因。
6.Westernblot检测
Westernblot检测显示，转化后的草属烟草中已成功表达CDPK蛋白，其相对分子质量约为63kD（图2）。
图1重组表达质粒pPICZ-CDPK
图2Westernblot检测结果
四、讨论
本文通过RT-PCR技术克隆出了黄瓜CDPK基因，并成功构建了携带CDPK基因的重组表达质粒pPICZ-CDPK。遗传转化实验结果表明，转化后的草属烟草中已得到CDPK基因的表达。因此，黄瓜CDPK基因在草属烟草中的功能研究将有望为研究黄瓜植株病害抗性及其调控机制提供实验依据。
黄瓜CDPK基因作为一种蛋白激酶，已经在植物的生长发育、病害抗性、盐碱逆境等多个生理过程中发挥了重要的作用。未来的研究可通过进一步克隆和转化黄瓜CDPK基因来探究这些生理过程的调节机制，为更高效的农业生产提供理论支持。
五、结论
本研究成功将黄瓜CDPK基因克隆入重组表达质粒中，并通过农杆菌介导的遗传转化技术将其转入草属烟草中进行表达。PCR和Westernblot检测结果表明，黄瓜CDPK基因已经成功地表达于草属烟草中。这为今后进一步探究黄瓜植株病害抗性及其调控机制提供了实验基础。