预览加载中，请您耐心等待几秒...

Western-Blot详解及问题分析.ppt

预览
1/10
2/10
3/10
4/10
5/10
6/10
7/10
8/10
9/10
10/10

亲，该文档总共42页，到这已经超出免费预览范围，如果喜欢就直接下载吧～

下载提示 文本预览

如果您无法下载资料，请参考说明：

1、部分资料下载需要金币，请确保您的账户上有足够的金币

2、已购买过的文档，再次下载不重复扣费

3、资料包下载后请先用软件解压，在使用对应软件打开

蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析WesternBlot简介 WesternBlot一般流程 WesternBlot常见问题分析WesternBlot简介：WesternBlot基本原理WesternBlot优点WesternBlot应用WesternBlot流程通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的定量蛋白样品的变性SDS：蛋白质-SDS胶束的特点：不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。凝胶成分PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：凝胶浓度与蛋白分离范围不连续电泳：灌制分离胶隔绝空气灌制积层胶插入梳子Stakinggel转膜转移膜的选择湿转系统半干转移系统丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。封闭一抗、二抗孵育二抗与底物反应显色膜解吸方法（膜的重复利用）WesternBlot结果分析WesternBlot常见问题分析SDS-PAGE电泳条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？转膜及抗体检测转移到膜上的蛋白很少膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高杂交信号很弱一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合FurtherReadings谢谢大家！