一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC-MS/MS方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113640423A(43)申请公布日2021.11.12(21)申请号202110954075.3G01N30/34(2006.01)(22)申请日2021.08.19(71)申请人复旦大学附属肿瘤医院地址200032上海市徐汇区东安路270号(72)发明人刘继勇姜良弟赵语南李爱雪顾永卫杜月李丹(74)专利代理机构上海顺华专利代理有限责任公司31203代理人蒋骏杰(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/72(2006.01)G01N30/04(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/86(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图6页(54)发明名称一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC-MS/MS方法(57)摘要本发明涉及生物检测分析领域，具体是一种测定生物样品中雷公藤甲素药物浓度的HPLC‑MS/MS方法，是以卡马西平为内标，用乙酸乙酯对血浆和各组织中的药物进行萃取，再使用高效液相色谱分离上清液中的药物成分，然后使用高分辨质谱多反应监测模式进行药物定性检测，并进行定量，实现对血浆和各组织样本中雷公藤甲素浓度进行分析测定。本发明优点在于：专属性强，精密度和准确度良好，方法回收率高，无明显基质效应，稳定性好，快速，通量高，灵敏度高等优点。本方法可用于雷公藤甲素血药浓度和组织浓度监测，指导雷公藤甲素的合理应用。CN113640423ACN113640423A权利要求书1/2页1.一种检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的方法为高效液相色谱联合质谱法，所述的生物样品为血浆和心肝脾肺肾组织，包括以下步骤：(A)储备液的制备：以甲醇为溶剂，配制得到雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液；(B)标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本的制备：取空白血浆和空白心肝脾肺肾组织匀浆液，加入步骤(A)制备的雷公藤甲素标准品储备液和内标卡马西平储备液，得到标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本；(C)标准曲线的设计：取步骤(B)得到的标准曲线血浆样本和标准曲线组织样本置于离心管中，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清液在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算雷公藤甲素峰面积和内标峰面积的比值，以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得回归方程即为血浆标准曲线和各组织标准曲线；(D)待测血浆样本和待测组织样本的制备：取待测血浆或组织匀浆液，加入乙酸乙酯萃取，涡旋离心后，取上清，用真空离心浓缩仪挥干，甲醇复溶，再次涡旋离心，取上清，即得到待测血浆样本或待测组织样本；(E)待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素药物浓度的计算：取步骤(D)制备的待测血浆样本和待测组织样本在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图，计算药物峰面积和内标峰面积的比值；根据步骤(C)得到的标准曲线计算待测血浆样本和待测组织样本中雷公藤甲素浓度。2.根据权利要求1所述的检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的标准曲线血浆和标准曲线各组织样本中雷公藤甲素浓度范围为：血浆20‑1000ng/mL；心50‑1000ng/mL；肝20‑1000ng/mL；脾20‑1000ng/mL；肺20‑500ng/mL；肾20‑1000ng/mL；标准曲线血浆样本和标准曲线各组织样本中内标卡马西平浓度均为lng/mL。3.根据权利要求1所述的检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的液相色谱条件和参数：WATERSACQUITYUPLCBEHC18色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；ACQUITYUPLCBEHC18VanGuardPre‑column保护柱：2.1mm×5mm，1.7μm；流动相为流动相A和流动相B；流动相梯度洗脱条件：0～4min，流动相A的体积分数为60％，流动相B的体积分数为40％；其中，流动相A为体积分数为100％甲醇，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流速为0.3mL/min，进样量10μL，柱温40℃，等度洗脱，时间为4min。4.根据权利要求1所述的检测生物样品中雷公藤甲素药物浓度的方法，其特征在于，所述的质谱条件和参数：电喷雾离子源ESI，正离子检测，多反应监测MRM工作方式；喷雾器电压：5500V；离子源温度：600℃；雾化温度：420℃；雾化器压力：40psi；碰撞气压：7psi；干燥气温度：350℃，干燥气流速：8L/min；鞘气温度：350℃，鞘气流速：11L/min，鞘气压力：23psi；毛细管电压：4000V；雷公藤甲素裂解电