屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究.doc

屋尘螨Ⅰ、Ⅱ类变应原T细胞表位融合肽疫苗的初步研究目的构建编码屋尘螨变应原Derp1和Derp2的T细胞表位融合肽嵌合基因的原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行大规模的诱导表达和纯化,并对纯化产物的特异性免疫治疗效果进行分析。方法1)将Derp1和Derp2的8个T细胞表位用“GPGPG"序列间隔串联为T1-8融合肽,利用DNA重组技术合成T1-8融合肽基因并插入质粒pET-28a(+),构建pET-28a(+)-T1-8载体,限制性内切酶双酶切验证并测序。2)将重组表达载体pET-28a(+)-T1-8转化到大肠埃希菌E.coilBL21(DE3)感受态中,菌落PCR筛选阳性克隆菌。3)用IPTG小剂量诱导表达,优化条件后进行大剂量诱导表达并纯化,SDS-PAGE和Westernblot(WB)验证表达和纯化产物。4)将40只BALB/c雌性小鼠随机分为4组,分别为阴性对照组(PBS组)、阳性对照组(Asthma组)变应原rDerp1和rDerp2混悬液治疗组(rDerp1/rDerp2组)以及T1-8融合肽治疗组(T1-8组)。用屋尘螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型,PBS组均以PBS缓冲液代替；两组治疗组分别于小鼠致敏第25天至27天雾化致敏前30min行背部皮下注射相应治疗蛋白；最后一次雾化激发24h后,收集各组小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)以及脾细胞培养上清(SSCC)。ELISA法检测BALF和SSCC中特异性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中变应原特异性IgE、IgG、IgG2。抗体水平,并行肺组织切片HE染色。结果1)BamHI/NotI双酶切结果以及测序结果显示成功构建pET-28a(+)-T1-8载体。2)菌落PCR结果显示成功转化至E.coilBL21(DE3)感受态中。3)SDS-PAGE以及WB验证表明该质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达。4)ELISA法检测结果显示,T1-8组和rDerp1/rDerp2组与Asthma组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17均降低,IFN-γ、IL-10均升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；T1-8组与rDerp1/rDerp2组相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低,IFN-γ、IL-10升高,血清中特异性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,均有统计学意义(P<0.05)。肺组织切片观察表明：T1-8组和rDerp1/rDerp2组肺部炎症较Asthma组明显减轻,且炎性细胞浸润显著减少,气道上皮结构重塑；T1-8组与rDerp1/rDerp2组相比,气道上皮结构与PBS组更为相近。结论成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-T1-8并进行了大规模表达和纯化；表达的T1-8融合肽对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗后可有效改善小鼠变态反应性气道及肺部炎症,可作为屋尘螨哮喘患者特异性免疫治疗的候选疫苗,以待进一步的研究。